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【感受態(tài)細胞的制備】 用CaCl2處理制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞

更新時間：2013-05-15 瀏覽次數(shù)：2751

1.  從37℃培養(yǎng)16~20 h 的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52），或1 ml 新鮮的16~20 h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個含有100ml LB培養(yǎng)基的1 L 或500 ml 培養(yǎng)瓶中。于37℃振搖培養(yǎng)約2~3 h（旋轉(zhuǎn)搖床200~300 r/min），每隔20~30 min測量OD600值≈0.4。

2.  在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個，用冰預冷的50 ml 聚丙烯離心管中，冰上放置10~20 min。

3.  于4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10 min，回收細菌細胞。

4.  將管倒置1 min，以使zui后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。

5.  以10 ml 用冰預冷的0.1 mM CaCl2重懸每份沉淀，放于冰上 ， 4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10 min，回收細菌細胞。

6.  每50 ml 初始培養(yǎng)物用2 ml 冰預冷的0.1 M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?/a>

7.  用無菌吸頭從感受態(tài)細胞懸液中取200 μl 轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，加DNA或連接反應混合物（體積≤10 μl，DNA≤50 ng），輕旋以混勻內(nèi)容物，冰浴30 min。

8.  將離心管放到預加溫到42℃的水浴中，90 s。

9.  將混合物快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻1~2分鐘，加入適當?shù)呐囵B(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)45 分鐘，使細胞復蘇，并表達質(zhì)粒所攜帶的轉(zhuǎn)化基因。

10.  將適當體積（每個90 mm平板可達200 μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到相應抗生素的平板培養(yǎng)基上。 

11.  將平板置于室溫至液體被吸收 ，倒置平板于37℃培養(yǎng)箱中，12~16 h，平板培養(yǎng)，克隆在此期間應該出現(xiàn)，否則轉(zhuǎn)化不成功。
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